在不对称PCR过程中，循环扩增结束时会产生大量的单链DNA产物。优化了不对称PCR反应循环数。结果如图3和图4所示。不对称PCR技术是在PCR体系中添加不等量的一对引物来扩增目的基因，并在后期产生大量的目的基因单链DNA（ssDNA）放大阶段。

如图11所示，当BSA添加量为20L时，检测线灰度值达到最大值，为577。同时，阴性对照组未出现条带。随着BSA添加量的增加，阳性组检测线的灰度值增加。价值有不同程度的下降。通过建立基于不对称PCR结合免疫层析技术的STEC标志性毒力基因stx的快速检测方法，可以达到快速准确分型STEC的目的。

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产志贺毒素大肠杆菌（STEC）又称肠出血性大肠杆菌，是一种分泌志贺毒素并对宿主肠粘膜上皮细胞造成粘附和擦拭损伤的腹泻病。大肠杆菌具有极强的致病性。 100 STEC 可引起感染，引起出血性结肠炎或血性腹泻。严重时可进一步发展为溶血性尿毒症综合征。

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随着下游引物数量的增加，stx1相应单链PCR的产量增加（图2A）。当stx1F:Biotin-stx1R浓度比为1:7时，将stx1制备的目标单链DNA进行免疫层析。分析时的最高灰度值结果（图1），平均灰度值为464.6。为了验证本实验建立并优化的STEC快速分型方法的特异性，选取23株菌株进行stx基因检测。

如图5和图6所示，stx2的最佳退火温度为55，检测线灰度值为362。在55~65退火温度期间，stx1的检测线平均灰度值组高于stx2组。当退火温度为59时，测得的检测线的平均灰度值最大为557。明胶作为封闭剂会严重影响聚苯乙烯微球上的DNA探针与目标单链DNA的特异性结合，导致实验组无法显色，故选择BSA作为最终封闭剂。

利用不对称PCR技术产生带有标记的单链DNA，并结合光学SPR生物传感器、纳米金比色法、电化学DNA生物传感器等其他技术，实现目标基因片段的快速、灵敏检测。由于一些反刍动物（如牛、羊等）体内细胞缺乏此类受体，感染后不太可能出现临床症状，因此成为STEC感染的最大宿主。人们经常食用携带STEC的肉制品或饮用被牛或羊粪便污染的饮用水或绿叶蔬菜而受到感染。

不对称PCR系统中添加的引物量影响整个扩增过程中产生的目标单链DNA产物的量。适当增加引物的添加量可以增加扩增结束时产生的目标单链DNA的量。在利用不对称PCR技术制备目标单链DNA的过程中，当限制引物（上游引物）耗尽时，剩余多余的下游引物以扩增初期产生的双链DNA为模板，进行扩增。相应的目标单链DNA因此添加的上下游引物的比例是影响单链DNA产量的关键因素。

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